人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA Kit

【實(shí)驗(yàn)方法】雙抗體夾心法

【種屬】人

【檢測(cè)范圍】 見(jiàn)說(shuō)明書

【檢測(cè)波長(zhǎng)】450 nm

【樣本類型】血清、血漿、組織、細(xì)胞上清及相關(guān)液體樣本

【反應(yīng)時(shí)間】 1.5~2h

人腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析(ELISA) 試劑盒使用說(shuō)明書 貨號(hào)：JYM0110Hu ? 本試劑盒僅供科研使用。 ? 本試劑盒用于體外定量檢測(cè)人血清、血漿、組織、細(xì)胞上清及相關(guān)液體 樣本中腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。 ? 有效期：6個(gè)月 ? 保存條件：2-8℃

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。用純化的 人腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次 加入腫瘤壞死因子α(TNF-α)，再與HRP標(biāo)記的腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體結(jié)合，形 成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下 轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成很終的黃色。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子 α(TNF-α)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 樣品中人腫瘤壞死因子α(TNF-α)濃度。

試劑盒組成

樣本處理及要求 1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì) 收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。 2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離 心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng) 該再次離心。 3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存 過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。 4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液， 細(xì)胞濃度達(dá)到 100 萬(wàn)/ml 左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離 心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng) 再次離心。

5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保 存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或 勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分 裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。 6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能 馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融. 7. 不能檢測(cè)含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。 操作步驟 1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10 孔，在第一、第二孔中分別加 標(biāo)準(zhǔn)品 100μl，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl，混勻；然后從第一 孔、第二孔中各取 100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn) 品稀釋液 50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 棄掉，再各取 50μl 分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50ul，混勻； 混勻后從第五、第六孔中各取 50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔 中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取 50μl 加到第九、 第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl，混勻后從第九第十孔中各 取 50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl，濃度分別為 300 pg/ml,200 pg/ml, 100 pg/ml, 50 pg/ml , 25pg/ml）。

2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè) 樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測(cè)樣品 10μl（樣品很終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁， 輕輕晃動(dòng)混勻。 3. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50ul，空白孔除外。 4. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。 5. 配液：將 30(48T 的 20 倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30(48T 的 20 倍)倍稀釋后備用。 6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如 此重復(fù) 5 次，拍干。 7. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50ul，再加入顯色劑 B50ul，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯 色 10 分鐘.

8. 終止：每孔加終止液 50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。 9. 測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。 測(cè)定應(yīng)在加終 止液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。 注意事項(xiàng) 1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如 未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。 2. 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。 3. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間很 好控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。 4. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，很好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本 OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測(cè)定， 計(jì)算時(shí)請(qǐng)很后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。 5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6. 底物請(qǐng)避光保存。 7. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn). 8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。 9. 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。 10. 如與英文說(shuō)明書有異，以英文說(shuō)明書為準(zhǔn)。 計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)， 在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋 倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計(jì)算出標(biāo) 準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值 代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋 倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

試劑盒性能 1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R 值為 0.92 以上。 2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于 9%和 15% 檢測(cè)范圍： 5pg/ml -400pg/ml

上海寶葉生物科技有限公司

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